目的  采用40層細(xì)胞工廠(40-layer cell factory, CF40)工藝培養(yǎng)原代地鼠腎(primary hamster kidney, PHK)細(xì)胞，優(yōu)化乙腦減毒活疫苗的生產(chǎn)工藝。

方法  用不同濃度新生牛血清培養(yǎng)不同接種密度PHK細(xì)胞，比較各組PHK細(xì)胞數(shù)量，確定CF40工藝的PHK細(xì)胞接種密度和新生牛血清濃度。通過對比CF40和15 L轉(zhuǎn)瓶采用不同新生牛血清的PHK細(xì)胞培養(yǎng)情況，比較兩種工藝對新生牛血清的選擇性。對4個廠家CF40培養(yǎng)的PHK細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行單因素方差分析，判定對CF40的選擇性。

結(jié)果  CF40工藝的*條件為PHK細(xì)胞接種密度6.1×10⁵ ml^-1、新生牛血清濃度6%。CF40工藝對新生牛血清的選擇性較低，能比轉(zhuǎn)瓶工藝更穩(wěn)定地培養(yǎng)更多的PHK細(xì)胞。4個廠家CF40培養(yǎng)的PHK細(xì)胞數(shù)量之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.23，P＞0.05），對CF40選擇性低。

結(jié)論  采用CF40可以制備出滿足乙腦減毒活疫苗生產(chǎn)要求的PHK細(xì)胞。

流行性乙型腦炎（乙腦）是經(jīng)蚊蟲傳播的急性神經(jīng)系統(tǒng)傳染病^[1-2]，全球每年報告約68 000 例乙腦病例，病死率約為30％，且在幸存者中，30％～50％會出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)和精神方面的后遺癥^[3]。目前較為有效的預(yù)防方法是接種乙腦減毒活疫苗，且大量臨床研究證明乙腦減毒活疫苗具有良好的免疫原性和安全性^[4-5]。隨著國家對預(yù)防用生物制品質(zhì)量和生產(chǎn)工藝要求的逐漸提高，企業(yè)應(yīng)采用可控性強(qiáng)、操作便利、節(jié)約生產(chǎn)成本和空間的生產(chǎn)工藝制備疫苗^[6]。

目前，乙腦減毒活疫苗采用的是15 L轉(zhuǎn)瓶工藝，而乙腦病毒單一病毒收獲液的收量取決于原代地鼠腎（primary hamster kidney, PHK）細(xì)胞的質(zhì)量，由于轉(zhuǎn)瓶工藝受控于人為因素較多，因此本試驗(yàn)采用40層細(xì)胞工廠(40-layer cell factory, CF40)工藝培養(yǎng)PHK細(xì)胞，并對各關(guān)鍵工藝參數(shù)及材料進(jìn)行優(yōu)化，以制備符合生產(chǎn)要求、一致性更好的PHK細(xì)胞。

PHK細(xì)胞由成都生物制品研究所有限責(zé)任公司（成都公司）病毒性疫苗一室使用成都公司動物室提供的10~14日齡黃金地鼠〔許可證號SCXK（川）2021-126〕制備。

新生牛血清分別購自蘭州榮曄生物科技有限責(zé)任公司、山西潤生大業(yè)生物材料有限公司、呼和浩特市草原綠野生物工程材料有限公司和美國Gibco公司，109培養(yǎng)基由成都公司配制，胰蛋白酶購自美國Gibco公司， CF40分別購自美國Corning公司、Nunc公司、FeiFanT公司和DHS公司；520 DI／REL蠕動泵購自斯派莎克工程（中國）有限公司，SHXJ-VIG(J)25瓶位轉(zhuǎn)瓶機(jī)購自蘭州飛控儀器總廠生化設(shè)備制造廠，Countstar IC1000全自動細(xì)胞計數(shù)儀購自上海睿鈺生物科技有限公司，XDS-1B倒置顯微鏡購自重慶重光實(shí)業(yè)有限公司。

將消化后的PHK細(xì)胞加入含不同濃度新生牛血清和0.1 mg /ml谷氨酰胺的109液體培養(yǎng)基，配制成為細(xì)胞懸液，添加NaHCO₃調(diào)節(jié)pH至約7.4。共配制6組細(xì)胞懸液，PHK細(xì)胞接種密度分別為4.5×10⁵、5.2×10⁵、6.1×10⁵、6.8×10⁵、7.3×10⁵、8.2×10⁵ ml^-1，每組3瓶，新生牛血清濃度分別為3%、6%、9%。將上述細(xì)胞懸液分別分裝約8 000 ml到Corning CF40中, 放入36~38 ℃孵室連續(xù)培養(yǎng)3 d，使用破窗錘將細(xì)胞工廠拆分成多個單層，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況，并以全自動細(xì)胞計數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。如果存在幾個結(jié)果近似的較優(yōu)新生牛血清濃度與PHK細(xì)胞接種密度的組合，則用這些組合重復(fù)試驗(yàn)，并以全自動細(xì)胞計數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，每個組合試驗(yàn)6次，選出*組合。

分別使用不同廠家、同一廠家不同批號或不同廠家混合的新生牛血清制備8組細(xì)胞懸液，每組2瓶，1瓶約8 000 ml，含6%新生牛血清，PHK細(xì)胞接種密度為6.1×10⁵ ml^-1，轉(zhuǎn)入到1個Corning CF40；另1瓶約14 000 ml，含8%新生牛血清， PHK細(xì)胞接種密度為4.7×10⁵ ml^-1，平均分裝到7個15 L轉(zhuǎn)瓶。將CF40和15 L轉(zhuǎn)瓶放入36~38 ℃孵室連續(xù)培養(yǎng)3 d，以全自動細(xì)胞計數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，對比兩種工藝對新生牛血清的選擇性。

制備含6%新生牛血清，接種密度為6.1×10⁵ ml^-1的PHK細(xì)胞懸液，分別分裝到Corning、Nunc、FeiFanT、DHS的CF40中，體積均約8 000 ml，36~38 ℃孵室連續(xù)培養(yǎng)3 d，以全自動細(xì)胞計數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，比較各廠家的CF40對培養(yǎng)PHK細(xì)胞的適用性，每種CF40均測定9次。

使用Excel 2016軟件對不同PHK細(xì)胞接種密度、不同新生牛血清濃度在CF40上培養(yǎng)的PHK細(xì)胞數(shù)量繪制折線圖分析；使用SPSS Statistics 25.0軟件對兩個較優(yōu)組合培養(yǎng)出的PHK細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。分別計算CF40和15 L轉(zhuǎn)瓶使用不同新生牛血清培養(yǎng)的PHK細(xì)胞數(shù)量的方差與極差，比較兩種工藝對新生牛血清的選擇性；使用SPSS Statistics 25.0軟件對不同廠家CF40培養(yǎng)的PHK細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

由表1和圖1可知，CF40中最佳PHK細(xì)胞接種密度為6.1×10⁵ ml^-1，6%、9%新生牛血清明顯優(yōu)于3%新生牛血清。對PHK細(xì)胞接種密度為6.1×10⁵ ml^-1時，6%、9%新生牛血清培養(yǎng)出的PHK細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行 t 檢驗(yàn)，t = -0.37，P =0.722。在最佳PHK細(xì)胞接種密度下，6%、9%新生牛血清培養(yǎng)出的PHK細(xì)胞數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義。從生產(chǎn)成本上考慮，確定*組合為6.1×10⁵ ml^-1細(xì)胞接種密度與6%新生牛血清濃度。

CF40使用不同新生牛血清培養(yǎng)的PHK細(xì)胞數(shù)量，標(biāo)準(zhǔn)差s₁=0.06×10⁹，極差R₁=0.15×10⁹，均值x?₁=2.04×10⁹；15 L轉(zhuǎn)瓶使用不同新生牛血清培養(yǎng)的PHK細(xì)胞數(shù)量，標(biāo)準(zhǔn)差s₂=0.29×10⁹，極差R₂=0.77×10⁹，均值x?₂=1.44×10⁹。s₁＜s₂，R₁＜R₂，說明CF40培養(yǎng)的PHK細(xì)胞數(shù)量波動更小；x?₁＞x?₂，說明CF40培養(yǎng)的PHK細(xì)胞數(shù)量更多。綜上，CF40工藝對新生牛血清的選擇性較低，使用各廠家、批號的新生牛血清均能培養(yǎng)出數(shù)量比15 L轉(zhuǎn)瓶工藝多的PHK細(xì)胞，具體數(shù)據(jù)見表2。

對4個廠家CF40培養(yǎng)的PHK細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行單因素方差分析，F=0.23，P=0.873。表明4個廠家CF40培養(yǎng)出的PHK細(xì)胞數(shù)量的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，即PHK細(xì)胞對CF40的選擇性不高，具體數(shù)據(jù)見表3。

乙腦病毒屬于胞外病毒，病毒在細(xì)胞內(nèi)完成復(fù)制組裝成熟之后會通過細(xì)胞膜進(jìn)入到病毒維持液中，只需輕輕晃動就可以收集單一病毒收獲液，這也是使用細(xì)胞工廠制備乙腦減毒活疫苗的天然優(yōu)勢。與15 L轉(zhuǎn)瓶工藝相比細(xì)胞工廠有較大的優(yōu)勢，比如操作簡單、節(jié)省空間、可控性好、靜止培養(yǎng)更利于細(xì)胞貼壁以及提高PHK細(xì)胞生產(chǎn)的一致性等，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于疫苗的生產(chǎn)和研發(fā)^[7]。

新生牛血清在PHK細(xì)胞培養(yǎng)中起到十分重要的作用，它能終止胰蛋白酶消化，提供細(xì)胞生長所需的貼壁因子、促生長因子、免疫球蛋白、胰島素等營養(yǎng)物質(zhì)^[8]。目前市場上血清種類繁多，不同廠家及同一廠家不同批次血清質(zhì)量存在差異，選擇合適的血清對細(xì)胞培養(yǎng)尤為重要^[9]。本試驗(yàn)采用了不同廠家或同一廠家不同批號或不同廠家混合的新生牛血清培養(yǎng)PHK細(xì)胞，試驗(yàn)結(jié)果表明，CF40工藝對新生牛血清的選擇性低，這可能是和細(xì)胞工廠本身的制造工藝和培養(yǎng)方式相關(guān)，細(xì)胞工廠培養(yǎng)表面經(jīng)過特殊處理，大大提高了細(xì)胞的吸附性，加之采用靜止培養(yǎng)方式，對新生牛血清中的貼壁因子要求不高^[10]。綜合CF40工藝新生牛血清濃度和對血清的選擇性，每亞批CF40使用約500 ml新生牛血清能穩(wěn)定地培養(yǎng)出約2.0×10⁹ PHK細(xì)胞，而15 L轉(zhuǎn)瓶工藝每亞批使用約1 100 ml新生牛血清，培養(yǎng)出的PHK細(xì)胞數(shù)目波動較大且遠(yuǎn)少于CF40工藝。

綜上，CF40工藝可以穩(wěn)定地培養(yǎng)出比15 L轉(zhuǎn)瓶工藝更多的PHK細(xì)胞，滿足乙腦減毒活疫苗生產(chǎn)需求，相比于目前不可控因素較多的轉(zhuǎn)瓶，不論是生產(chǎn)過程控制還是產(chǎn)品質(zhì)量方面都會有提高。