細數流式細胞儀驗證的基本流程

1．流式細胞儀介紹

流式細胞儀(Flowcytometry)是對于處在快速直線流動狀態中的細胞或生物顆粒同時利用檢測器進行多參數、快速的自動分析和分選的裝置。它可以快速測量、存貯、顯示懸浮在液體中的分散細胞的一系列重要的生物物理、生物化學方面的特征參量，并可以根據預選的參量范圍的細胞亞群從中分選出來。 但流式細胞儀的細節分辨率為零，即它只能測量一種細胞的總核酸量，總蛋白量等指標，而不能鑒別和測出某一特定部位的核酸或蛋白的具體數目。流式細胞儀主要由液流系統、光學系統、檢測系統、分析系統四部分組成。目前已廣泛應用于細胞生物學、免疫學、臨床醫學、基礎科學研究、細胞遺傳學、生物化學等研究的各個領域。

2．流式細胞儀的原理

流式細胞儀的工作原理為：將經特異性熒光染料染色后的待測細胞放入樣品管中，細胞在氣體的壓力下進入充滿鞘液的流動室，然后鞘液和樣品流在噴嘴附近組成一個圓柱流束，與水平方向的激光束垂直相交，染色的細胞受激光照射后發出熒光或產生散射光，這些信號分別被光電倍增管熒光檢測器和光電二極管散射光檢測器接收，轉變為電信號后，經過計算機儲存、計算、分析這些數字化信息，就可得到細胞的大小、活性、核酸含量、酶和抗原的性質等物理和生化指標。

3．相關術語

設門：劃定某一區域的細胞群體，對其單獨加以分析或分選。

調補償：若兩種以上的熒光素的發射光譜之間存在重疊，則需要調補償。

MFI值：即為平均熒光強度。

4．為什么流式細胞儀要做驗證呢？

流式細胞儀是對細胞或生物顆粒物理、化學等相關參數的自動分析和分選的裝置，對流式細胞儀進行驗證就是保證分析檢測結果準確、可靠，所以必須對所用到的組成系統各部分進行驗證，以證明該系統符合檢測的目的和要求，這就是儀器驗證。本質上講，儀器驗證就是根據檢測物質的要求，預先對儀器設置一定的參數范圍及合適的檢測器，并通過設計合理的試驗來驗證該儀器是否符合檢測項目的要求。這些驗證項目如分辨力、線性相關系數、重復性、示值誤差等某一個產生誤差，其他的都會有一定的偏移，致使結果改變。儀器驗證就是保證整個試驗是否能成功的先決條件，只有經過驗證的儀器，確保該儀器各部分都在良好的情況下才能用于細胞相關參數的分析、分選，使檢測結果得到保證，使誤差降低到最小。

5．流式細胞儀的驗證項目

（1）  安裝確認

a.  文件確認

b.  附件確認

c.  安裝環境確認

d. 安裝情況確認

（2）  運行功能確認

a.  運行功能確認

b.  軟件控制功能測試

（3） 性能確認

a.  分辨力測試

b.   線性相關系數測試

c.  檢出限測試

d.  漂移測試

e.  重復性測試

f.  示值誤差測試

6．流式細胞儀的操作步驟

(1)  檢測鞘液桶和廢液桶的狀態是否滿足本次使用，蓋緊黑蓋；

(2)  檢測穩壓電源，打開電源，對系統進行預熱5-10分鐘；

(3)  打開氣體閾，調節壓力，獲得適宜的液流速度，應排除管路中氣泡；開啟光源冷卻系統；

(4)  在樣品管中加入去離子水，沖洗液流的噴嘴系統；

(5)  利用校準標準樣品，調整儀器，使在激光功率、光電倍增管電壓、放大器電路增益調定的基礎上，0和90散射的熒光強度*，并要求變異系數為最小；

(6)  選定流速、測量細胞數、測量參數等，在同樣的工作條件下測量樣品和對照樣品；同時選擇計算機屏上數據的顯示方式，從而能直觀掌握測量進程；

(7)  樣品測量完畢后，再用去離子水沖洗液流系統；

(8)  因為實驗數據已存入計算機硬盤（有的機器還備有光盤系統，存貯量更大），因此可關閉氣體、測量裝置，而單獨使用計算機進行數據處理；

(9)  最后將所需結果打印出來，操作完畢，關機。

7．注意事項

a.   光電倍增管要求穩定的工作條件，所有需放置在避光的環境下；另外還要注意磁屏蔽；

b.   光源不得在短時間內（一般要1h左右）關上又打開；使用光源必須預熱并注意冷卻系統工作是否正常；

c.   液流系統必需隨時保持液流暢通，避免氣泡堵塞；

d.   鞘流液使用前要經過過濾、消毒，必須符合使用要求；

e.   不同的檢測對象選用對應的濾片系統、放大器的類型等；

f.   特別注意的是每次檢測都需要空白對照組，做對照試驗；

g.   調節電壓時，如果檢測的目標細胞體積較小，可以適當提高電壓值。

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