熒光定量PCR儀校準(zhǔn)方法與結(jié)果情況

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀特異性更強(qiáng)，自動(dòng)化程度更高，且有效地解決了PCR污染的問題，應(yīng)用領(lǐng)域及應(yīng)用量都不斷增加。但其設(shè)計(jì)更為復(fù)雜，溫度模塊和光學(xué)系統(tǒng)設(shè)計(jì)同時(shí)影響其性能和實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性，為定量PCR儀校準(zhǔn)帶來了巨大挑戰(zhàn)。采用生物試劑等方式對定量PCR儀熒光部分校準(zhǔn)缺乏溯源性，無法分析誤差來源，存在較大缺陷。

PCR儀操作簡單、靈敏度高，被廣泛地應(yīng)用于分子生物學(xué)中。但傳統(tǒng)PCR儀不能準(zhǔn)確定量，操作過程中易污染使得假陽性率高等缺陷。熒光定量PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的積累實(shí)時(shí)監(jiān)控整個(gè)PCR反應(yīng)過程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。這一技術(shù)特異性更強(qiáng)，自動(dòng)化程度更高，且有效地解決了PCR污染。

因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀逐步取代普通PCR儀在臨床檢驗(yàn)、檢驗(yàn)檢疫、法醫(yī)鑒定、疾病控制、體外診斷試劑制造和研發(fā)、生物技術(shù)產(chǎn)品研發(fā)等領(lǐng)域得到了更為廣泛的應(yīng)用。熒光定量PCR儀在普通PCR儀的技術(shù)上增加了熒光激發(fā)裝置和檢測系統(tǒng)，包含激發(fā)光光源、濾光片、鏡頭和熒光檢測器等。檢測系統(tǒng)有超低溫ＣＣＤ成像系統(tǒng)和光電倍增管ＰＭＴ。

熒光定量PCR儀光學(xué)校準(zhǔn)方法與結(jié)果分析的性能起到?jīng)Q定性控制作用，共同決定最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。因此，對定量PCR儀的校準(zhǔn)需求也逐步從單純的溫場校準(zhǔn)轉(zhuǎn)向溫度加熒光的復(fù)合參數(shù)校準(zhǔn)。

１，熒光定量PCR儀校準(zhǔn)現(xiàn)狀

相對于傳統(tǒng)PCR儀，熒光定量PCR儀的影響因素更為復(fù)雜，主要因素包含化學(xué)試劑、溫度模塊的溫度因數(shù)、頂蓋溫度因數(shù)、鏡頭、反光鏡和光路通道、熒光接收器的敏感度、機(jī)械組成部分、熒光信號(hào)處理軟件的閾值設(shè)定，如基線，基線設(shè)定，Ｓ／Ｎ比例探測等，這就為熒光定量PCR儀的校準(zhǔn)帶來了巨大的挑戰(zhàn)。

國內(nèi)校準(zhǔn)機(jī)構(gòu)目前針對熒光定量PCR儀的校準(zhǔn)主要分為兩種情況：

一種是僅對熒光定量PCR儀的溫場部分進(jìn)行校準(zhǔn)，這種方法無法對熒光定量PCR儀光學(xué)部分進(jìn)行校準(zhǔn)，所獲得的結(jié)果不能對熒光定量PCR儀的性能進(jìn)行全面評估；

另外一種方法是利用化學(xué)試劑對熒光定量PCR儀的進(jìn)行熒光檢測，這種方法同樣存在極大缺陷。首先采用化學(xué)方法對定量PCR儀熒光系統(tǒng)進(jìn)行校準(zhǔn)，無法溯源到任何*的標(biāo)準(zhǔn)，不具備溯源性。其次，梯度稀釋試劑的過程中由于人為操作會(huì)引入一定的誤差，誤差值可能較大，直接影響到最終的檢測結(jié)果。最重要的是，采用這種方法進(jìn)行校準(zhǔn)，無法說明熒光定量PCR儀的溫度和熒光對最終定量結(jié)果的影響關(guān)系，誤差多少及誤差來源等。

隨著定量PCR儀的應(yīng)用越來越廣泛，使用者迫切需要對熒光定量PCR儀的性能進(jìn)行評估。在現(xiàn)有檢測手段無法滿足需求的情況下，熒光定量PCR儀使用者普遍采用兩種方式自行對儀器狀態(tài)進(jìn)行判斷，一種是使用生物試劑測試盤這種檢測方法和采用已知濃度的質(zhì)粒ＤＮＡ標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對樣本線性誤差進(jìn)行校準(zhǔn)的方法都屬于化學(xué)方法，這種方法僅能夠針對孔與孔間的組合線性進(jìn)行測量，所得結(jié)果僅能代表PCR儀孔與孔間的平均結(jié)果，不能代表單孔的線性，無法真實(shí)反映儀器的性能。另一種方法是采用多臺(tái)不同廠家或型號(hào)定量PCR儀實(shí)驗(yàn)比對的方式來比較不同儀器間的系統(tǒng)誤差，判斷系統(tǒng)誤差是否在臨床接受范圍內(nèi)。這種方法既不具備溯源性，又需要對單個(gè)項(xiàng)目進(jìn)行實(shí)驗(yàn)比對，成本較高。

影響定量PCR儀結(jié)果重復(fù)性的２個(gè)主要原因是邊緣效應(yīng)和實(shí)驗(yàn)誤差，而邊緣效應(yīng)是由于光路設(shè)計(jì)缺陷和控溫模塊缺陷導(dǎo)致的。如果光路設(shè)計(jì)存在缺陷，會(huì)導(dǎo)致PCR儀樣品槽的邊緣孔和中間孔光程存在差異，不同反映孔間熒光基團(tuán)獲得的激發(fā)光能量存在差異，最終影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。同時(shí)，加熱模塊的空間溫差同樣會(huì)導(dǎo)致這種邊緣效應(yīng)，研究表明，孔間溫差的微小差別可能在基因擴(kuò)增的過程中被指數(shù)級(jí)放大，最終影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。此外，光路設(shè)計(jì)缺陷和孔間溫差的存在還會(huì)直接影響到熔解曲線的結(jié)果，使得不同儀器對熔解曲線的分辨率存在明顯差異。在通過熔解曲線檢測突變或進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性分析時(shí)，這種影響會(huì)導(dǎo)致無法成功區(qū)分突變基因或誤判突變基因。

因此，對定量PCR儀更加全面科學(xué)的校準(zhǔn)方式是采用可溯源物理手段同時(shí)對熒光定量PCR儀的溫度部分和光學(xué)部分進(jìn)行校準(zhǔn)，并分析二者之間的聯(lián)系，以保障實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

２，定量PCR儀光學(xué)校準(zhǔn)系統(tǒng)

基于上述定量PCR儀校準(zhǔn)需求，本文采用Cyclertest3Doptical定量PCR儀光學(xué)校準(zhǔn)系統(tǒng)對定量PCR儀的溫場和熒光系統(tǒng)進(jìn)行全面校準(zhǔn)。系統(tǒng)在原有的PCR儀溫度校準(zhǔn)系統(tǒng)基礎(chǔ)上運(yùn)用可溯源光譜理論，將溫度和熒光檢測相結(jié)合，模擬定量PCR儀試驗(yàn)，不僅可以對溫度模塊、上蓋溫度進(jìn)行檢測，還能同時(shí)對熒光系統(tǒng)進(jìn)行檢測，并分析而二者的相關(guān)性，更準(zhǔn)確地確定定量PCR儀誤差及誤差來源。

前端傳感器示意圖檢測系統(tǒng)鑲嵌經(jīng)校準(zhǔn)并可用光譜儀溯源的發(fā)光LEG，通過給定電流量的不同會(huì)產(chǎn)生不同區(qū)強(qiáng)度的熒光模擬標(biāo)準(zhǔn)熒光激發(fā)，并通過對熒光激發(fā)部分的溫度控制。

這種設(shè)計(jì)避免了光譜的漂移，保證LEG的激發(fā)光在運(yùn)行過程中保持絕對的同一水平，這種采用物理手段進(jìn)行檢測，避免了人為操作引入的誤差，更加準(zhǔn)確。這種熒光檢測方法通過了國際認(rèn)證，運(yùn)用了可溯源光譜理論，可溯源溫度計(jì)量來對熒光定量PCR進(jìn)行*的檢測，系統(tǒng)根據(jù)溯源性、可靠性和準(zhǔn)確性。

系統(tǒng)溫度部分可以對定量PCR儀的溫度準(zhǔn)確度、孔間溫差、實(shí)時(shí)升溫速率、實(shí)時(shí)降溫速率、溫度過沖、溫度持續(xù)時(shí)間、上蓋溫度進(jìn)行校準(zhǔn)。熒光部分可以對定量PCR儀的Ｃｑ（Ｃｔ）相差值、精確度、熒光飽和值、熒光線性、熔解曲線精確度及一致性，熔解溫度的比例關(guān)系及線性靈敏度等進(jìn)行檢測。

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